TP Bioinformatique ESIL 2eme Annee: Partie I

Analyse Fonctionnelle d'une famille de protéines

Objectifs

• Réaliser l'analyse fonctionnelle détaillée d'une famille de protéines, exclusivement à l'aide d'outils Internet.

A la fin de ce travail, vous devez avoir

• déterminé precisément la fonction de la proteine étudiée, par analyse de séquence
• identifié tous les domaines de la protéine et leur fonction
• localisé tous les résidus essentiels, le site catalytique, les sites de liaison au(x) substrat(s)
• déterminé l'existence de protéines paralogues
• determiné dans quel ensemble d'organismes on retrouve ces fonctions (orthologues et paralogues).

Le protocole implémenté s'approche de celui recommandé par Bork et Koonin (Nature genetics, 1998, 18, 313). Bien que la fonction de la protéine étudiée soit en fait déjà connue, le protocole doit être appliqué dans son integralité. Les resultats seront inclus dans le rapport.

Vous devez trouver les sites web vous-même en vous aidant des pointeurs donnés en cours ou des serveurs de liens CAB (http://igs-server.cnrs-mrs.fr) et ABI (http://www-biol.univ-mrs.fr).



Protéines étudiées:

• Groupe 1: antiterminateur de transcription SacY de B. subtilis
• Groupe 2: DNA polymérase I d'E. coli

Conseils:

• Sauvegardez en HTML les resultats intermediaires de façon à pouvoir éventuellement relancer certaines recherches (Attention: les sorties de Blast sont énormes. Faites le ménage à la fin du TP.)
• Sauvegardez les graphiques intéressants pour une insertion eventuelle dans le rapport.
• Utilisez au maximum les bookmarks-signets pour eviter dávoir a retrouver les sites importants.

a) Récupération de la séquence

• En vous aidant des mots-clé, récupérez la séquence protéique de départ avec Entrez ou SRS. (SRS: plus complet, Entrez: plus facile)
• Sauvegardez la séquence sur votre compte Windows NT.

b) Eléments structuraux

Le but est ici de repérer toutes les régions susceptibles de nous déranger dans la recherche d'homologies.
• Régions transmembranaires. Utiliser pour les prédire l'un des sites Web répértoriés sur le serveur ABI.
• Répétitions internes: Utiliser 'Blast 2 sequences' (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) et comparer la sequence a elle-meme. (Si la séquence comporte des régions identiques, on voit apparaitre des diagonales dans le résultat graphique).
• Régions de basse complexité: elles seront filtrées (remplacées par des N) automatiquement lorsque vous utiliserez Blast au NCBI (option filter: default). Donc ne les recherchez pas tout de suite.

c) Identification de domaines/motifs connus.

Première approche pour l'identification des domaines et/ou motifs fonctionnels de la protéine: la recherche dans les banques de motifs et de domaines.
• Identifiez les motifs potentiels en interrogeant le serveur Prosite. Lisez la documentation des motifs trouvés (Lignes "DO" ou "PDOC" de la fiche Prosite)
• Identifiez les domaines potentiels au moyen du serveur PFAM.

d) Recherche de similarité

On recherche ici le plus grand nombre possible d'homologues à la séquence de départ. Dans cette collection, nous distinguerons ensuite les orthologues des paralogues.
• Rechercher des homologues avec le serveur Blast du NCBI (utiliser la version du serveur offrant un "graphical overview")
• Recherches réciproques (Blast) pour vérifier validité des homologies: Pour tout match d'origine douteuse: effectuer une recherche réciproque. Si la protéine d'origine ne sort pas dans les premières solutions, rejeter.
• Recherches iteratives (toujours Blast) pour récupération d'homologies eloignées. Des homologies significatives peuvent avoir échappé à la première recherche. Repartez d'une séquence du base de la liste et refaites un Blast. Recommencez jusqu'a ce qu'aucune nouvelle séquence n'apparaisse, ou que les nouvelles séquences n'aient visiblement plus rien à voir.
• Classer toutes les séquences obtenues en orthologues/paralogues. Identifier les régions d'homologie (un paralogue peut être similaire à la séquence de départ sur un domaine seulement).
  
  ATTENTION:
  • Utiliser la bonne banque et la bonne version de Blast. Vous cherchez des protéines, et vous en voulez le plus possible!
  • Dans les réponses, vous obtiendrez peut être des artefacts. Attention aux 'ALU warning' et autres matches inintéressants!
  • Attention aux valeurs de E > 10^-3.
  • Vous obtiendrez peut-être plusieurs fois la même protéine sous des noms différents. Ne les gardez pas toutes.
  • Il ne s'agit pas de garder aveuglément les N meilleures séquences. Ne perdez pas de vue que l'un des objectifs est de rechercher dans quel ensemble d'organismes se retrouve cette (ces) fonction(s).

e) Alignement multiple

C'est à partir d'un alignement multiple que l'on identifiera les résidus essentiels. On en tirera des conclusions sur la catalyse et la liaison au substrat.
• Préparez l'alignement multiple en séparant orthologues et paralogues ou, mieux, en extrayant tous les domaines homologues (para et ortho) et en réalisant un alignement multiple pour chaque domaine.
• Réalisez l'alignement multiple avec l'un des serveurs Clustalw disponibles.
• Importer l'alignement dans un traitement de texte. Numérotez les résidus, repérez domaines et aa conservés. Rapprochez ces résultats de ce qui est connu de l'activité et de la structure de la protéine.

f) Prédiction de la structure / vérification (optionnel)

Les structures des proteines choisies ont été résolues (au moins partiellement par RMN ou cristallographie. Vous avez donc la possibilité de vérifier les performances des logiciels de prédiction de structures secondaires.
• Prédire la structure secondaire avec l'un des principaux logiciels disponibles (par ex. la méthode PHD de l'EMBL Heidelberg)
• Récupérer la structure 3D de la protéine dans la PDB
• Visualiser cette structure avec Rasmol
• Identifier les éléments secondaires visuellement et dans le fichier pdb (parfois listés dans les commentaires), comparer avec prédictions.
• Produire une sortie graphique (JPG, GIF) à inclure dans le rapport.

Rapport

• Rapport réalisé sous Word ou, pour ceux qui savent le faire, HTML.
• Le rapport débute par une introduction sur les objectifs du travail, puis par un chapitre Matériel et Méthodes.
• N'oubliez aucune étape du TP.
• En conclusion, faites intervenir les connaissances réelles sur la protéine étudié (un peu de bibliographie est indispensable).