Objectifs

• Réaliser l'analyse fonctionnelle détaillée d'une famille de protéines, exclusivement à l'aide d'outils Internet.

A la fin de ce travail, vous devez avoir

• déterminé precisément la fonction de la proteine étudiée, par analyse de séquence
• identifié tous les domaines de la protéine et leur fonction
• localisé tous les résidus essentiels, le site catalytique, les sites de liaison au(x) substrat(s)
• déterminé l'existence de protéines paralogues
• determiné dans quel ensemble d'organismes on retrouve ces fonctions (orthologues et paralogues).

Le protocole implémenté s'approche de celui recommandé par Bork et Koonin (Nature genetics, 1998, 18, 313).

Vous devriez idéalement être en mesure de trouver les sites Web vous-même en vous aidant des pointeurs donnés en cours ou des serveurs de liens CAB (http://igs-server.cnrs-mrs.fr) et ABI (http://www-biol.univ-mrs.fr).

Protéines Proposées. Elles présentent des intérêts différents, soit plusieurs domaines (parfois réutilisés dans d'autres protéines) soit une structure 3D connue, soit un gène resté longtemps non identifié, soit l'existence de paralogues. Au choix:
 
1. Famille des facteurs d'epissage SR (SRp30, SRp40, SRp46, etc.)
2. ORF YBL024w de S.cerevisiae, chromosome II (fonction recemment decouverte par homologie, non annotee dans le genome, pas de St. 3D)
3. Antiterminateur de transcription SacY de B. subtilis
4. Gln tRNA synthetase (coli)
5. Asp tRNA synthetase (coli)
6. Ser tRNA synthetase (coli)
7. Maltose binding periplasmic protein (coli)
8. Transcriptional regulatory protein OMPR (coli)
9. Cellulase A (clostridium thermocellum)
10. Parvalbumine (humaine)

Conseils Généraux:

• Sauvegardez en HTML les resultats intermediaires de façon à pouvoir éventuellement relancer certaines recherches (Attention: les sorties de Blast sont énormes.)
• Sauvegardez les graphiques intéressants (format JPG ou GIF) pour une impression eventuelle
• Utilisez au maximum les bookmarks-signets pour eviter d'avoir à retrouver à chaque fois les sites utiles.

---

a) Récupération de la séquence

• En vous aidant des mots-clé, récupérez la séquence protéique ou nucléique de départ avec Entrez ou SRS. (SRS: plus complet, Entrez: plus facile)
• Sauvegardez la séquence sur votre compte Windows NT.

b) Eléments structuraux

Le but est ici de repérer toutes les régions susceptibles de nous déranger dans la recherche d'homologies.
• Régions transmembranaires. Utiliser pour les prédire l'un des sites Web répértoriés sur le serveur ABI (Par ex. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-1.0).
• Répétitions internes: Utiliser "PLALIGN" (http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta/plalign.htm) afin de comparer la sequence à elle-même. Si la séquence comporte des régions identiques, on voit apparaitre des diagonales dans la sortie graphique, ou plus d'un alignement dans la sortie texte.
• Régions de basse complexité: elles seront filtrées (remplacées par des N) automatiquement lorsque vous utiliserez Blast au NCBI (option filter: default). Si vous êtes curieux(se), vous pouvez désactiver cette option et voir en quoi elle affecte les résultats.
• Séquences Alu, Sine, L1, etc.: Elle peuvent être filtrées en utilisant "advanced Blast". On ne se pose pas la question pour les séquences procaryotiques.

c) Identification de domaines/motifs connus

Première approche pour l'identification des domaines et/ou motifs fonctionnels de la protéine: la recherche dans les banques de motifs et de domaines.
• Identifiez les motifs potentiels en interrogeant le serveur Prosite (http://www.expasy.ch/tools/scnpsit1.html). Lisez la documentation des motifs trouvés (Lignes "DO" ou "PDOC" de la fiche Prosite)
• Identifiez les domaines potentiels au moyen du serveur PFAM (http://www.sanger.ac.uk/Pfam/).

d) Recherche de similarité

On recherche ici le plus grand nombre possible d'homologues à la séquence de départ. Dans cette collection, nous distinguerons ensuite les orthologues des paralogues.
• Rechercher des homologues avec le serveur Blast (advanced) du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). Faites la recherche au niveau protéique (logiciel = blastp)
• Collecter les séquences qui paraissent homologues à votre séquence de départ. Pour les biologistes, la lecture de la fiche Swissprot de la protéine de départ (si elle existe, ou d'un article de Review sur cette fonction) peut s'avérer utile pour vérifier que les résidus ayant donné lieu au score Blast élevé sont effectivement fonctionnellement importants. Pour les non biologistes, cette tache est

ATTENTION:
• Utiliser la bonne banque et la bonne version de Blast. Vous cherchez des protéines, et vous en voulez le plus possible!
• Dans les réponses, vous obtiendrez probablement des artefacts. Attention aux 'ALU warning' et autres matches inintéressants!
• Attention aux valeurs de E.
• Vous obtiendrez peut-être plusieurs fois la même protéine sous des noms différents. Ne les gardez pas toutes.
• Il ne s'agit pas de garder aveuglément les N meilleures séquences. Ne perdez pas de vue que l'un des objectifs est de de collecter des homologues éloignés.
• Pour tester la validité d'une homologie, on peut parfois effectuer une recherche réciproque. Si la protéine d'origine ne sort pas dans les premières solutions, rejeter.
• Recherches iteratives (toujours Blast) pour récupération d'homologies eloignées. Des homologies reelles peuvent avoir échappé à la première recherche. Repartez d'une séquence du bas de la liste et refaites un Blast. Recommencez jusqu'a ce qu'aucune nouvelle séquence n'apparaisse, ou que les nouvelles séquences n'aient visiblement plus rien à voir avec la fonction de depart.
• A titre de comparaison, le même travail peut être effectué avec PSI-Blast (toujours serveur du NCBI), qui réalise automatiquement l'itération.
• Tentez de classer toutes les séquences obtenues en orthologues/paralogues. Identifier les régions d'homologie (un paralogue peut être similaire à la séquence de départ sur un domaine seulement).

e) Alignement multiple

C'est à partir d'un alignement multiple que l'on identifiera les résidus essentiels. On en tirera des conclusions sur la catalyse, la liaison au substrat ou tout autre aspect fonctionnel.
• Préparez l'alignement multiple en séparant orthologues et paralogues ou, mieux, en séparant les domaines et en réalisant un alignement multiple pour chaque domaine.
• Réalisez l'alignement multiple avec le serveur Clustalw disponible a l'EBI ( http://www2.ebi.ac.uk/clustalw). Cochez l'option treetype=NJ.
• Vous récupérez un alignement et un arbre. Sauvegardez l'arbre en format "Phylip" (arbre parenthésé) et affichez-le avec le programme njplot. Vérifiez vos hypothèses sur les paralogues et orthologues.
• Importez l'alignement dans un traitement de texte. Les biologistes peuvent tenter de rapprochez ces résultats de ce qui est connu de l'activité et de la structure de la protéine (voir fiche Swissprot, connaissances personnelles ou articles).

f) Validation 3D

Les structures des protéines choisies ont été résolues (au moins partiellement) par RMN ou cristallographie. Vous avez donc la possibilité d'expliquer la présence et la nature des résidus conservés par des arguments structuraux.
• Récupérez la structure 3D de la protéine dans la PDB. (Utilisez directement une recherche par mots-clé sur le serveur de la PDB: http://www.pdb.bnl.gov )
• Visualisez cette structure avec Rasmol (logiciel installé localement)
• Identifiez les éléments secondaires visuellement et dans le fichier pdb (parfois listés dans les commentaires), comparez avec les signatures que vous aurez etablies. Vous pouvez cliquer sur la structure afin d'identifier des residus particuliers.
• Produire une sortie graphique (JPG, GIF) imprimable ou publiable sur le Web.